摘要
目前，从人血清中快速、高效地分离和表征脂蛋白已经成为冠状动脉疾病鉴别和研究的重要技术。密度梯度超速离心法（Density gradient ultracentrifugation）是分离不同脂蛋白组分的金标准。在本应用说明中，我们使用了CS150NX 微型超速离心机和 S140AT 固定角转，其最大相对离心力为 1,050,000 x g（140,000 rpm），最大样品容量为 10 x 2 mL，能够高效地从人全血中分离脂蛋白。
经实验验证，此款紧凑型台式超速离心机采用密度梯度离心法可有效分离含有 1）乳糜微粒（CLM）和超低密度脂蛋白（VLDL）2）中密度脂蛋白（IDL）和低密度脂蛋白质（IDL）及 3）高密度脂蛋白（HDL） 三种不同组分。
传统的高速离心方案有时需要长达 60 小时来分离单类脂蛋白组分。相较之下，该离心机能够在更短时间内（5小时）完成分离。此外，因为所有步骤均可使用相同类型的梯度介质液和离心管，整体实验流程能够最大限度地减少和简化耗材和试剂的使用。
脂质是天然存在的分子，包括脂肪、胆固醇、甘油三酯和磷脂等。此前，人们将脂质视作能量储存的来源和细胞膜的组成部分 1。目前，我们已经了解到脂质在细胞内信号传导和膜运输中所发挥的多项关键作用 2-3。由于具备疏水特性，脂质被包裹在作为载体的球形脂蛋白颗粒中 4。脂蛋白是一种复杂的颗粒，其中心疏水核心由胆固醇和甘油三酯等非极性脂质组成。外层由磷脂、游离胆固醇和载脂蛋白的亲水膜组成5。脂蛋白颗粒的主要功能是将体内的细胞外水份和血浆中的疏水分子运输到各个细胞和组织中 6。血浆脂蛋白根据其大小、脂质成分和载脂蛋白可分为七类。外壳中所含的特定载脂蛋白决定了其功能特性 7。随着乳糜微粒（CLM）到残留乳糜微粒（CLM Rem）、超低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白、低密度脂蛋白（LDL-I、II 和 III）、高密度脂蛋白（HDL2 和 HDL3）和脂蛋白（a）（Lp（a））的密度逐渐递增，我们可以根据密度差异来分离脂蛋白 5,8,9。脂蛋白的特性见表 15,8,9。
表1：脂蛋白分类
| 谱系名称 | 密度范围（g/mL） | 粒径 （nm） |
主要载脂蛋白 | 其他 | 主要功能 |
| 乳糜微粒（CLM） | < 0.93 | > 75 | ApoB-48 | ApoA-I,-IV ApoC-I, -II, -III ApoE | 转运外源性甘油三酯 |
| 残留乳糜微粒 （CLM Rem） |
0.93-1.006 | 30-80 | ApoB-48 | ApoE | 转运甘油三酯和胆固醇 |
| 超低密度脂蛋白 （VLDL） |
0.93-1.006 | 30-80 | ApoB-100 | ApoA-I, -II, -V ApoC-I, -II, -III ApoE | 转运内源性甘油三酯 |
| 中密度脂蛋白 （IDL） |
1.006-1.019 | 25-35 | ApoB-100 | ApoC-I, -II, -III, ApoE | 低密度脂蛋白前体 |
| 低密度脂蛋白（LDL） | 1.019-1.063 | 18-25 | ApoB-100 | 将胆固醇和磷脂转运 至外周细胞 | |
| 高密度脂蛋白 （HDL） |
1.063-1.121 | 5-12 | ApoA-I | ApoA-II, -IV, -V, ApoCIII, ApoE | 将胆固醇和其他脂质 从血浆转运至组织 |
| 脂蛋白（a） | 1.055-1.120 | 25 | Apo B-100 | Apo (a) | 转运胆固醇 |
低密度脂蛋白（LDL，也称为“ 坏 ”胆固醇）、超低密度脂蛋白（VLDL）和脂蛋白（a）的血浆水平升高以及高密度脂蛋白（HDL，也称为“ 好 ”胆固醇）的水平降低是导致冠状动脉疾病的危险因素 1,4,10,11。由于脂蛋白水平与病情发展之间存在密切联系，因此人们现在将这些脂蛋白视为冠状动脉疾病研究的良好生物标志物 12。
在这一领域，人们正在研究越来越多的脂蛋白检测和分离方法。脂蛋白可以通过不同方法进行分离，包括超速离心法 13、排阻色谱法 14、凝胶电泳法 15、聚阴离子沉淀法 16 和免疫特异性吸附法 17。
密度梯度超速离心法根据密度差异来分离脂蛋白，而密度差异则取决于脂蛋白中脂质和蛋白质的比例。例如，乳糜微粒（CLM）几乎只含有脂质，非常轻，密度低于水。另一方面，像高密度脂蛋白这样的小型脂蛋白只含有 50% 的脂肪，剩余部分由更高密度的蛋白质组成，使得其密度介于 1.063g/mL和 1.25 g/mL 之间。
密度差异是脂质命名的基本依据，而密度梯度超速离心则是测定脂质密度的标准参考方法 18,19。在本文中，我们展示了Eppendorf CS150NX 微型超速离心机通过简化的工作流程并减少耗材与试剂用量，可以在紧凑的实验室空间中从人血清中分离脂蛋白组分的方法。
材料与方法
血清制备
从健康个体中收集人全血，并在室温（RT）下凝结 30 分钟。使用 Eppendorf 5810 R 台式冷冻离心机以 2000 x g 离心 10 分钟，去除凝块，并立即将收集的上清液（血清）转移到新的离心管中。然后，进行分装保存在 -20°C 下以供进一步分析。
使用超速离心法分离血清脂蛋白
根据脂蛋白的水合密度，使用带有 S140AT 固定角转的Eppendorf CS150NX 紧凑型台式超速离心机，通过顺序浮选超速离心法 20 分离脂蛋白（图 1）。此款冷冻型台式超速离心机的速度高达 1,050,000 x g（140,000 rpm），并且配备超快的加速和减速功能，能够确保快速分离样品。
图 1：A Eppendorf CS150NX 离心机 B 轻松装配
和使用 S140AT 转子 C Eppendorf CS150NX
离心机顶视图
血清脂蛋白的分级分离
密度溶液的制备方法如下：
— 密度溶液 A（ρ：1.006 g/mL）：将 11.4 g NaCl （0.195 M）、0.1 g EDTA-2Na（0.001%）和 1 mL NaOH（1N）混合，并用 500 mL 蒸馏水溶解。加入蒸馏水使总体积达到 1 L，然后再加入 3 mL 蒸馏水。使用分析天平检查溶液密度。加水，直到溶液达到所需密度 21。
— 密度溶液 B（ρ：1.182 g/mL）：将 24.98 g NaBr（2.44 M）溶解于 100 mL 溶液 A。
— 密度溶液 C（ρ：1.478 g/mL）：将 78.32 g NaBr（7.65 M）溶解于 100 mL 溶液 A。
将总共 600 μL 血清转移至 1 mL 1 PC 离心管（Eppendorf，货号：5720 411 000）。为了更好地观察离心后的脂蛋白组分，在另一个相同处理的离心管中，使用苏丹红 7B（SFT - Sigma，货号：201618）对血清进行预染色。染料溶液是：溶于 1 mL 二甲基甲酰胺（Carl Roth，货号：T921.1）的 2 mg 苏丹红 7B 溶液，使用前预先用 1 mL 0.1 M NaOH（Sigma，货号：72068）和 50μL Triton X-100（Merck，货号：1.12298.0101）进行激活。将 12μL苏丹红 7B 染料溶液添加到体积为 600 μL 的含血清离心管中，上下颠倒进行混匀。
向两个离心管中分别加入 300μL 密度溶液 A，并通过上下颠倒轻轻混匀。混匀后，将离心管装入 10 x 2 mL S140AT固定角转中，16°C，140,000 rpm（1,050,000 x g），离心 50分钟（加速：9；减速：7）。将减速档位设置为 7，以避免干扰离心结果。
离心结束后，使用移液器去除含有 CLM 和 VLDL 组分的顶层（最多 300μL）（图 2A）；向含有 IDL、LDL、HDL、白蛋白和血清蛋白的剩余组分（约 600μL）中加入 300 μL 密度溶液 B。16°C, 140,000 rpm（1,050,000 x g）, 离心 80 分钟（加速：9；减速：7）。
离心后，使用移液器去除含有 IDL 和 LDL 组分的顶层（最多300μL）（图 2B）；在最后一道分离步骤中，将 300μL 密度溶液 C 添加至剩余组分。16°C, 140,000 rpm（1050,000 x g）离心 140 分钟（加速：9；减速：7）。
离心结束后，使用移液器吸取仅含有 HDL 组分的顶层（图2C）。所有分离组分应存储于 -20°C，以备后续使用。
通过蛋白质印迹法分析组分中的载脂蛋白
按照 Novex™ Tris-Glycine SDS 技术指南（Thermo Fisher Scientific，货号：LC2677），在还原和变性条件下制备用于凝胶电泳的样品和缓冲液。简言之：将 10μL Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液和 2μL NuPAGE™还原剂添加到每个组分的 8μL 样品中。将样品混合，在 85°C 下加热 2 分钟，然后将每份样品（20μL）装入 Novex WedgeWell 4-20% Tris-Glycine 蛋白凝胶（Thermo Fisher Scientific，货号：XP04205BOX）的上样孔中。（使用到的蛋白质 marker 是：WesternSure 预染色化学发光蛋白 ladder，Li-cor，货号：926-98000）。每个凝胶按如下条件进行电泳：恒压：225V，浓缩胶电流：125mA，
图 2：脂蛋白分离示意图。A）CLM和VLDL组分，B）IDL和LDL组分，C）HDL组分。SFT=苏丹红7B
注：乳糜微粒（CLM）、超低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）
分离胶电流：70-80mA。电泳完成后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（Thermo Fisher Scientific，货号：88025）上。在室温下使用 Intercept（TBS）封闭缓冲液（Li-Cor，订购号：927-65001）封闭 1 小时，而后在 4°C 下使用在封闭缓冲液中稀释的一抗（表 2）孵育过夜。一抗孵育完成后，将膜转移至在封闭缓冲液中稀释的二抗（表 2）中，室温下孵育 1 小时。使用化学发光底物（WesternSure PREMIUM，Li-Cor，货号：926-95000）进行反应，并在 C-DiGit Western Blot 扫描仪（Li-Cor，货号：3600-00）上进行成像。
表 2：一抗和二抗列表
| 一抗 | 稀释比例 | 二抗 | 稀释比例 |
| ApoA1 单克隆小鼠抗体 (ThermoFisher Scientifific，货号：MIA1404) |
1:1,000 | WesternSure山羊抗小鼠二抗 (Li-cor，货号：926-80010) |
1:100,000 |
| ApoB (B-100) 单克隆小鼠抗体 (R&D systems，货号：MAB4124) |
1:250 | WesternSure山羊抗小鼠二抗 | 1:100,000 |
| ApoE 单克隆兔抗体 (ThermoFisher Scientifific，货号：701241) |
1:200 | WesternSure山羊抗兔二抗 (Li-cor，货号：926-80011) |
1:100,000 |
结果与讨论
我们可以通过测定脂质或载脂蛋白的数量来对脂蛋白进行评估。上文通过使用 CS150NX 离心机，采用超速离心法成功分离了不同的脂蛋白，随后我们通过蛋白质印迹法在不同组分中对三种主要的载脂蛋白进行了鉴定（图 3）。如前所述，载脂蛋白 A1（ApoA1）是构成高密度脂蛋白（HDL）的主要蛋白成分。这种分子量为 28 kDa 的蛋白质是一种可交换的蛋白质，其可在不同脂蛋白颗粒之间进行转移。如图 3A 所示，载脂蛋白 A1 主要存在于高密度脂蛋白（HDL）组分中。
载脂蛋白 B（ApoB，B-100）分子量为 550 kDa，是超低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白质（LDL）的组分。载脂蛋白 B 被定义为一种锚定在脂蛋白颗粒中的不可交换成分。如图 3B 所示，它主要存在于低密度脂蛋白组分中。载脂蛋白 E（ApoE，34kDa）是一种可交换的成分，主要存在于超低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中；然而，这种载脂蛋白也可以与低密度脂蛋白（IDL）等其他脂蛋白结合。在本文中，它主要出现在低密度脂蛋白 + 中密度脂蛋白（LDL+IDL）组分中，而在其他两个组分（CLM+VLDL 和HDL）中含量较低（图 3C）
图 3：蛋白质印迹法展示了在每个组分中检测到三种主要载脂蛋白：A）载脂蛋白 A1（ApoA1）、B）载脂蛋白 B（ApoB）和 C）载脂蛋白 C（ApoC），并对其进行表征。用超速离心获得的连续组分进行上样，并在 4-20% SDS-PAGE 凝胶上电泳。
乳糜微粒（CLM）、超低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）
结论
在本文所述的离心方案中，我们使用微型超速离心机以单一速度通过密度梯度法快速分离了血清脂蛋白组分。但当一些组分含有两类脂蛋白时，我们可以使用 CS150NX 微型超速离心机通过更复杂的密度梯度离心法来分离单类脂蛋白。通过使用最大相对离心力为 513,000 x g22 的连续离心步骤，可以实现单类脂蛋白和亚组分的进一步分离。综上，本文描述了一种易于使用的分离方法，能够在五小时内将脂蛋白分离成三个组分。此款多功能紧凑型 Eppendorf微型超速离心机仅需 90 秒即可达到最高效分离脂蛋白所需的最大相对离心力：1,050,000 x g（140,000 rpm）。相较之下，采用其他替代方案分离单类脂蛋白则可能需要长达 60 小时 23。
使用 CS150NX 离心机和 S140AT 固定角转，并以最大RCF 分离三种脂蛋白组分，时间优势显著。此外，这种方法与 CS150NX 离心机的强大功能相结合还可用于其他应用，如病毒和大分子分离以及核糖体纯化。
总之，CS150(F)NX 微型超速离心机搭配 S140AT 固定角转，能够提高脂蛋白组分的分离速度，并简化工作流程。
总结
> 脂蛋白是冠状动脉疾病生物标志物研究的重要议题
> 既有方法可能需要长达 60 小时才能分离单类脂蛋白
> 本应用说明展示了如何使用 CS150NX 或 CS150FNX 微型超速离心机搭配 S140AT 固定角转，在五小时内分离脂蛋白组分的方法
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